Proyectos de investigación

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SINAE realiza proyectos de investigación y desarrollo con fondos públicos y privados, a través de la colaboración con entidades públicas como la Universidad Pablo de Olavide y el Centro Andaluz de Biología del Desarrollo (CABD), y privadas nacionales e internacionales como el Jones Institute, en la Eastern Virginia Medical School (Norfolk, Virginia, EEUU), OriginElle (Montreal, Canadá), Cegyr (Buenos Aires, Argentina), Reprogenetics (Livinstone, New Jersey, EEUU), Recombine EU, (Bilbao), IVF Spain (Alicante), Ginemed (Sevilla) y Hospital Miguel Servet (Zaragoza).

Desarrollo de un nuevo método de diagnóstico para la receptividad endometrial.

El endometrio es un tejido que sufre enormes cambios periódicos a lo largo del ciclo menstrual, y estos cambios responden fundamentalmente a una regulación por parte de las hormonas esteroideas y moléculas paracrinas secretadas desde las células vecinas. El ciclo del endometrio se puede dividir en tres fases, esto es, la fase proliferativa, que se corresponde a la fase folicular en el ovario, la fase secretora, correspondiente a la fase lútea en el ovario, y la fase menstrual. Para que la implantación embrionaria tenga éxito debe existir una sincronía entre el desarrollo del embrión y del endometrio.

El término que se utiliza para definir  la competencia del endometrio a la implantación del embrión en estado de blastocisto es “receptivo”, y ocurre durante pocos días en cada ciclo menstrual, inducido por el aumento de las concentraciones de estrógenos y progesterona a mediados de la fase secretora, entre otros factores. Este periodo de estado óptimo para la interacción materno-embrionaria se conoce como la ventana de implantación (WOI, por sus siglas en inglés), y se da entre los días 20 y 21 del ciclo menstrual, siete días después del pico de LH endógena que desencadena la ovulación.

Este proyecto de investigación tiene como objetivo la caracterización a nivel molecular de los marcadores definidos en la firma molecular de la receptividad endometrial, atendiendo a factores necesarios para la receptividad endometrial y para el control de la respuesta inmunológica; para desarrollar en última instancia una nueva herramienta diagnóstica del estado de receptividad endometrial.

La plataforma elegida para ello es BioMark 96.96 IFC Dynamic Array de Fluidigm. Esta nueva plataforma de PCR cuantitativa a tiempo real (qRT-PCR) está basada en sondas TaqMan, requiere menos cantidad de reactivos que otras técnicas, menos pasos de pipeteo, usa mezclas de reacción a escala nanométrica y, lo más importante, permite el estudio simultáneo de 96 genes en 96 muestras. De esta forma, el análisis por qRT-PCR en esta plataforma es robusto, más sencillo y más asequible.

plataforma 96

Figura 1. Imagen de la plataforma 96.96 IFC Dynamic Array de Fluidigm.

Inducción de apoptosis en células estromales del endometrio bajo el tratamiento con cobre

El dispositivo intrauterino de cobre (DIU) libera una cantidad de cobre en el tejido endometrial humano que induce cambios fisiológicos y bioquímicos en las células endometriales. Este método tiene efectos secundarios, principalmente dolor y sangrado. El cobre, un elemento esencial, es tóxico cuando se presenta en exceso en los tejidos de los mamíferos y puede generar apoptosis. Durante la ejecución de la apoptosis, la red de microtúbulos apoptóticos (AMN, de sus siglas en inglés, apoptotic microtubule network) se forma para prevenir que las células liberen su contenido al espacio extracelular.

Se diseñó un proyecto con el objetivo de investigar el efecto apoptótico del cobre en las células estromales del endometrio humano en la misma concentración que el cobre liberado por el DIU y estudiar la presencia de AMN. Para ello se dispusieron de células estromales obtenidas de biopsias endometriales de mujeres a las que se aplicaron tres concentraciones de cobre diferentes, reproduciendo las distintas fases del ciclomenstrual (proliferativa, secretora y menstrual). Se analizó el porcentaje de células apoptóticas por inmunofluorescencia, se cuantificó la apoptosis por observación de la fragmentación del núcleo, la falta de citoesqueleto de actina y la morfología celular a través de microscopía de contraste de fases. De esta forma se comprobó que el tratamiento con cobre originaba la formación de AMN en las tres concentraciones empleadas, sin diferencias significativas entre cada una de ellas y sin un aumento de la apoptosis con el tiempo de exposición al cobre. Por tanto, la inducción de apoptosis por el cobre liberado por el DIU podría ser responsable del sangrado uterino que se produce en las mujeres con este dispositivo.

Figura 2. Formación de AMN, ausencia de citoesqueleto de actina y fragmentación del núcleo (marcado con Hoechst) a las 48h tras el tratamiento con cobre (CUS). CPT: camtotecina, droga citotóxica empleada como control positivo.

 Formacion de AMN

Análisis de expresión de marcadores tumorales en muestras de tumores humanos para la creación de tests predictores de supervivencia libre de metástasis y conocer el estado de detoxificación celular

Los últimos datos de la OMS muestran una incidencia de 14,1 millones de casos nuevos de cáncer y 8,2 millones de muertes por cáncer en el mundo. Si se separa la población por sexos, el cáncer de pulmón es el tipo de cáncer que posee una tasa de mortalidad más alta en los hombres y el cáncer de mama, en las mujeres. El análisis de expresión global de tejidos tumorales ha permitido la identificación de huellas o patrones de expresión característicos de un tipo tumoral. Gracias a estas huelas transcriptómicas se han diseñado distintos marcadores de prognosis, los cuales sirven para generar tests predictores que separan a los pacientes en distintos grupos de riesgo, predicen la evolución del tumor o la respuesta a tratamiento. En la actualidad, existen varios tests validados por la FDA para su uso en EE.UU., como Ampliseq, Oncotype Dx o MammaPrint. Sin embargo, es conveniente desarrollar nuevos tests más económicos, más sencillos, con una mayor eficacia y que proporcionen mayor información para diseñar protocolos de quimioterapia más eficientes.

El objetivo del proyecto es generar tres tests predictores:

  • Un test para predecir la supervivencia libre de metástasis en adenocarcinoma de pulmón, basado en una huella transcriptómica de 36 genes.
  • Un test para predecir la supervivencia libre de metástasis en cáncer de mama, basado en una huella transcriptómica de 40 genes.
  • Un test para conocer el estado de detoxificación celular, basado en el análisis de 12 genes de transportadores ABC implicados en la resistencia a quimioterapia (MDR, multidrug resistance).

La plataforma elegida para estos tests es BioMark 96.96 IFC Dynamic Array de Fluidigm. Esta nueva plataforma de PCR cuantitativa a tiempo real (qRT-PCR) está basada en sondas TaqMan, requiere menos cantidad de reactivos que otras técnicas, menos pasos de pipeteo, usa mezclas de reacción a escala nanométrica y, lo más importante, permite el estudio simultáneo de 96 genes en 96 muestras. De esta forma, el análisis por qRT-PCR en esta plataforma es robusto, más sencillo y más asequible.

Se ha realizado la validación de las sondas diseñadas para analizar la expresión de cada gen diana de manera cuantitativa, y se ha obtenido ADNc del ARN total de biopsias de pacientes con adenocarcinoma de pulmón. Por tanto, una vez se disponga de ADNc de biopsias de pacientes con cáncer de mama, se realizará el análisis de expresión de los marcadores en la plataforma Fluidigm y un análisis estadístico para construir los tests predictores.

Figura 3. Esquema de prognosis genética en cáncer (adaptado de Lujambio y cols., 2012).

 prognosis genetica en cancer
 Búsqueda de marcadores de embarazo ectópico en sangre periférica.

El embarazo ectópico se define como la gestación que tiene lugar fuera de la cavidad uterina siendo la principal causa de morbilidad y mortalidad en mujeres jóvenes. Los principales factores de riesgo son daños anatómicos en las trompas de Falopio, cirugías previas, infecciones y tabaquismo, riesgo que se ve aumentado en tratamientos de reproducción asistida y fecundación in vitro. Sin embargo, existen una gran cantidad de embarazos ectópicos en mujeres sin factores de riesgo. La mayor complicación del embarazo ectópico es la hemorragia interna que puede conducir a la muerte. Un 1,3% de los embarazos en los Estados Unidos son ectópicosy en los últimos estudios epidemiológicos se estima que representan el 6% de las muertes de mujeres en gestación, datos extrapolables a la población europea.

El diagnóstico precoz del embarazo ectópico mejora considerablemente los pronósticos sobre la morbilidad. Actualmente el único diagnóstico posible se realiza a través de mediciones seriadas de β-hCG (generando en el Reino Unido a un gasto anual de 9 millones de libras esterlinas) y de ecografía, y en muchas ocasiones, es necesario el seguimiento del caso durante una semana o más, para llegar a un diagnóstico fiable. Es por este motivo por el que es necesario un sistema diagnóstico eficiente, objetivo y precoz.

Los exosomas son nanovesículas secretadas por las células tras la fusión de vesículas internas con la membrana plasmática. El contenido molecular de los exosomas representa el tipo celular del que procede y su estatus fisiológico. Los exosomas se encuentran fácilmente en fluidos corporales, especialmente sangre y orina y son una herramienta diagnóstica probada para muchos tipos de cáncer, enfermedades neurodegenerativas y otras patologías.

Figura 4. Biogénesis de exosomas y microvesículas extracelulares (MVE) (Raposo y Stoorvogel, JCB 2013).

 biogenesis

El presente proyecto pretende caracterizar marcadores procedentes de exosomas en sangre periférica de mujeres con embarazo ectópico utilizando las nuevas tecnologías “-ómicas”, y usarlos para el diagnóstico precoz del embarazo ectópico. La identificación de marcadores precoces en el embarazo ectópico tendría un gran impacto en nuestra sociedad, reduciendo la mortalidad de las embarazadas, la cirugía, la pérdida de fertilidad que el embarazo ectópico genera, reduciendo, al mismo tiempo, los costes de los sistemas diagnósticos actuales.

Actualmente se han realizado, con fondos propios, microarrays de expresión génica para el estudio del genoma completo (Whole Genome 44K, Agilent Technologies) a partir de ARN total de sangre materna de mujeres con embarazo ectópico (n = 6) y uterino (n = 6). El estudio generó una lista de 57 genes diferencialmente expresados, 44 sobre expresados y 13 reprimidos más de dos veces (FC>2,0) estadísticamente relevantes (p-value<0,05). Además, se ha llevado a cabo el diseño de sondas y la validación de los resultados obtenidos en los microarrays por medio de PCR cuantitativa (RT-PCR) de algunos genes: ORM 1, ORM 2 y UTS2, utilizando las muestras sometidas a microarrays de expresión génica: embarazo ectópico (n=6) y de embarazo intrauterino (n=6).