Próxima conferencia en Buenos Aires, Argentina, 3 de Diciembre, como conmemoración del aniversario de la clínica Procrearte.

El Dr. Horcajadas mostrará los resultados obtenidos en los últimos años sobre los avances en metabolómica y selección embrionaria. Trabajo realizado en colaboración con el Dr. Hussain Abdulla de la Universidad de Texas.

A continuación les dejamos el informe elaborado por el Dr. José A. Horcajadas y Dr. Hussain Abdulla

José Antonio Horcajadas

Identificación de biomarcadores del potencial de desarrollo de embriones humanos en FIV: un nuevo enfoque no invasiva

Motivación:

La fecundación in vitro (FIV) se ha convertido en una modalidad eficiente a nivel mundial para tratar los factores de infertilidad masculina y femenina. El éxito de la FIV depende en gran parte en la selección precisa de los embriones. En este estudio, nuestra hipótesis está basada en que las pequeñas moléculas secretadas o consumidas por los embriones cultivados in vitro pueden ser detectadas en el medio condicionado, y/o que los cambios de concentración de estas pequeñas moléculas u otros compuestos en el medio expuesto a los embriones, pueden ser cuantificados por innovadores métodos bioquímicos con una gran sensibilidad y especificidad, proporcionando información altamente predictiva sobre el potencial de implantación.

Métodos:

Hemos examinado diferentes métodos de extracción de muestras para el análisis de las moléculas secretadas o consumidas por los embriones cultivados en medio Sage®. Éstos incluyen métodos de extracción en fase sólida como C18, C8, PPL y ultrafiltración. Hemos hallado que la ultra-ultrafiltración Amicon® con corte de 3 kDa retiene el máximo número de moléculas (alrededor de 1800) comparado con las 100-300 moléculas obtenidas por métodos de extracción en fase sólida. Basándonos en estos resultados hemos seleccionado la técnica de ultrafiltración para optimizar los resultados. Además hemos examinado el impacto de los volúmenes a estudiar y hemos hallado que un volumen tan pequeño como un 1µl puede ser usado para las pruebas con óptimos resultados, proporcionando un beneficio adicional al permitir múltiples mediciones de la misma muestra. La reproducibilidad de las diferentes pruebas de los mismos medios de muestra en diferentes días fue excelente. Es importante destacar que no observamos diferencias en los resultados al comparar muestras frescas frente a congeladas y descongeladas, y descartamos cualquier posible interferencia causada por la contaminación ocasional del aceite al momento de pipetear la muestra.

Las pequeñas moléculas del medio de cultivo condicionado fueron separadas de las proteínas usando ultra-ultrafiltración Amicon® con membranas de celulosa regenerada de baja unión de corte 3kDa. La fracción retenida (>3kDa) incluyó la mayoría de las proteínas y fue congelada a -80ºC para futuros estudios según corresponda. El filtrado (que contenía la mayoría de las moléculas pequeñas) fue diluido 1:100 con metanol grado LC-MS. La submuestra se infundió de forma continua en la fuente de iones de Apollo II ESI de un BrukerDaltonics 12 Tesla Apex Qe FTICR-MS que funciona en modo de ión negativo. Antes del FTICR-MS, para el análisis del modo de ión negativo, se añadió hidróxido de amonio a todas las muestras, dando una concentración final de 0,1% de NH4OH.

Resultados:

Se analizaron un total de 133 muestras de medio de cultivo; 103 medios correspondían a pacientes no embarazadas (52 pacientes) y 30 muestras de pacientes que consiguieron un embarazo (15 pacientes). El análisis fue llevado a cabo cuando los embriones estaban en día 3 de cultivo. Usando el modo negativo del análisis FTICR-MS hemos identificado sobre 5.500 moléculas pequeñas únicas presentes en estas muestras  de medio de cultivo. Cuando aplicamos el análisis del principal componente (PCA) a la lista de masas de FTICR, se demostró que los tres primeros componentes principales representaban el 71% de las diferencias entre los diferentes medios condicionados. Además, todos los medios condicionados del grupo de los embarazos se agruparon en el lado izquierdo de PC1, mientras que el grupo de las muestras que no embarazaron se dispersó a lo largo de los otros dos componentes principales. El grupo de todos los medios condicionados que dieron embarazos (Embarazo (E), 30 muestras) en la misma región indica que comparten perfiles moleculares muy similares. Por otro lado, la dispersión de los medios condicionados que no dieron embarazos (No Embarazo (NE), 103 muestras) mostró que:

  1. 66 muestras de NE (64%) se agruparon lejos de las muestras de E, lo que indica perfiles muy diferentes de las muestras de E
  2. ii) Además, 37 de las muestras de NE (36% del total de las no embarazo) mostraron un perfil de moléculas más o menos similar al del medio P (lo que representa también el desarrollo ideal en los medios de cultivo ya que se agruparon en la misma región que el medio condicionado E)

Una posible explicación para estas muestras es que la ausencia de embarazo en estos casos fue el resultado de otros factores negativos de implantación o endometriales después de la extracción de los embriones de los medios de cultivo; y/u otros factores embrionarios independientes de las moléculas secretadas por los embriones.

El análisis de la carga espectral de los tres mayores componentes principales del análisis de PCA mostró que las masas específicas más responsables de diferenciar entre las muestras E y NE se encontraban en una región del gráfico de PCA, y las muestras NE estaban localizadas en otra región del gráfico PCA. Basándonos en estos resultados pudimos concluir que hay diferencias significativas en los perfiles moleculares en los medios condicionados (usados) que dieron embarazos comparados con los medios condicionados que no dieron embarazos durante el desarrollo embrionario bajo condiciones de cultivo in vitro. Esto nos llevó a preguntarnos si podríamos predecir si un embrión se implantaría con éxito en función del perfil molecular de los medios condicionados del embrión.

Para probar la previsión de una implantación exitosa basada en los perfiles moleculares del subconjunto de medios de cultivo que hemos analizado, utilizamos el Análisis Discriminante de Regresión de Mínimos Cuadrados Parciales (regresión PLS-DA). Este modelo de análisis se utiliza para predecir el resultado de la implantación a partir de los espectros de masas de cada muestra. El PLS-DA es un modelo de regresión multivariable de los datos y comienza dividiendo los datos en dos subgrupos:

  • El subgrupo de calibración PLS-DA, que consistió en 15 muestras E y 50 muestras NE elegidas al azar.
  • El subgrupo de predicción PLS-DA.

El subgrupo de calibración se utilizó para encontrar la mejor relación entre la intensidad de las masas compuestas (como variables independientes) con los resultados de implantación conocidos (como variables dependientes). El modelo fue capaz de encontrar una mejor regresión entre las masas compuestas y el resultado de la implantación con r2 = 0,99. El subgrupo de predicción consistió en los espectros de masas de las 11 muestras E y las 18 muestras NE no incluidas en el subconjunto de calibración. El subconjunto de predicción se utilizó para probar la predictibilidad del modelo para el resultado de las muestras desconocidas.

El modelo de regresión fue capaz de predecir 11 de las 11 muestras que tienen un perfil de embarazo (E) (un 100% de éxito para la predicción de la implantación) Mientras que para las de un perfil de no embarazo, el modelo pudo predecir que 13 de las 18 muestras tenían un perfil de no embarazo (NE) (72% de éxito para la predicción de fracaso de la implantación). Prevemos que un nuevo PLS-DA basado en los datos actuales tendrá una capacidad predictiva aún mejor. Además, mediante el desarrollo de un algoritmo MATLAB personalizado, pudimos predecir el resultado de la implantación de las muestras en un plazo de cinco horas (desde el momento en que se recogieron los medios usados) utilizando nuestro modelo de calibración PLS-DA. Después de evaluar la precisión de nuestro modelo predictivo, analizamos las muestras para identificar biomarcadores potenciales para el embarazo de embriones. Identificamos 15 potenciales biomarcadores para la predicción de la implantación embrionaria, los cuales se muestran a continuación en la tabla 1.

Tabla 1. Lista de biomarcadores potenciales para medios condicionados (usados) en embriones que dieron un embarazo (E) y sin embarazo (NE).

ID Fórmula molecular Posible clase compuesta Presente en embarazo Presente en no embarazo Posible biomarcador (net)
Posibles biomarcadores para medios condicionados con embarazo (P)
1 C12H10N2O11P2 Compuestos de fosfato 86% 3% 83%
2 C11H19O5S2P1 Compuestos de fosfato 100% 17% 83%
3 C13H10N2O12P2 Compuestos de fosfato 100% 17% 83%
4 C11H10N4O13P2 Compuestos de fosfato 91% 9% 82%
5 C10H15N3O10S1P1 Compuestos de fosfato 100% 20% 80%
6 C11H14O12S2P2 Compuestos de fosfato 100% 20% 80%
7 C11H13N1O12S2P2 Compuestos de fosfato 100% 20% 80%
8 C15H12O10S2P2 Compuestos de fosfato 91% 12% 79%
9 C15H14N2O15S1P2 Compuestos de fosfato 91% 15% 76%
10 C14H17N2O5S2P1 Compuestos de fosfato 82% 9% 73%
11 C19H39O4S2P1 Compuestos de fosfato 73% 0% 73%
Biomarcadores potenciales para medios condicionados sin embarazo (N)
1 C37H70N2O2 Péptido pequeño 0 % 100% 100%
2 C32H42O3 Ácidos grasos 0 % 100% 100%
3 C20H38O4 Ácidos grasos 0% 79% 79%
4 C18H32N2O4 Péptido pequeño 4% 71% 67%

Basados en los resultados mostrados en la tabla 1, pudimos identificar potenciales biomarcadores (n=11) que son específicos para medios condicionados de embriones que dieron un embarazo. Por otro lado, pudimos identificar otros biomarcadores (n=4) que solo están presentes en los medios condicionados (usados) por los embriones que no dieron embarazos. Estos potenciales biomarcadores muestran claramente que, si bien el medio condicionado (usado) era rico en compuestos específicos de fosfato (todos los 11 biomarcadores de embarazo son compuestos de fosfato), el medio condicionado (usado)  en los que no dieron embarazo se caracterizó por la presencia de péptidos pequeños y ácidos grasos específicos. Esto indica que el embrión que dio un embarazo pasa por vías completamente diferentes en comparación con los embriones que no embarazan. Ninguno de estos compuestos está presente en las muestras de control (medios acondicionados sin embriones).

Direcciones futuras:

Nuestro objetivo final de investigación es identificar biomarcadores no invasivos para la implantación embrionaria a nivel molecular. La selección clínica de estos biomarcadores debe ser rápida y relativamente fácil de detectar, de modo que puedan ser utilizados en una amplia variedad de prácticas clínicas en todo el mundo para optimizar la selección de embriones de alta calidad. Esto aumentaría la probabilidad de que solo se pudiera transferir un solo embrión para obtener un parto vivo, lo que conllevaría una disminución de la carga socioeconómica y médica de las gestaciones múltiples.

Nuestro enfoque inicial no invasivo ha proporcionado información crucial sobre el peso molecular exacto (hasta seis decimales) de algunas pequeñas moléculas potenciales, y nos ha permitido calcular una fórmula molecular de cada una de ellas con menos de 1 ppm de precisión. Sin embargo, las técnicas de MS de ionización suave no nos permitirán identificar las estructuras químicas exactas de estos biomarcadores. Para lograr este objetivo utilizaremos un enfoque complementario. Aislaremos solo los iones de las pequeñas moléculas con potencial de biomarcadores en el cuadrupolo de FTICR-MS, y luego los iones aislados se fragmentarán por espectroscopia de masas en tándem (MS / MS) de FTICR-MS; ya sea utilizando la disociación inducida por colisión (CID), la disociación de captura de electrones (ECD) o modos de disociación multifotónica infrarroja (IRMPD). La elección del método de fragmentación óptimo dependerá de la naturaleza química de la pequeña molécula biomarcadora. Además, si es necesario, para la verificación independiente de las estructuras químicas de los biomarcadores, se utilizarán LCQ-DUO LC / MS y GC-TOF-MS. Esto nos permitirá identificar de manera inequívoca las estructuras  químicas exactas de los biomarcadores con una precisión muy alta.  Esta fase inicial del descubrimiento será seguida en el futuro inmediato por el desarrollo de ensayos más simples basados en biomarcadores completamente identificados, y con el paso a clínica se validará realizando estudios de FIV prospectivos que se pueden aplicar en diferentes clínicas de todo el mundo.

Antes de sugerir la aplicación adecuada del traslado a la clínica, determinaremos las estructuras químicas precisas de estos biomarcadores identificados, que son responsables de las diferencias entre los medios condicionados usados en embriones que dan un embarazo de los que no.

La elección del análisis químico simple apropiado para el traslado al uso clínico dependerá principalmente de las estructuras moleculares de estos biomarcadores específicos. Por ejemplo, el uso de la cromatografía de gases con un simple detector de espectroscopia de masas (GC-MS) y una columna de separación correcta será ideal para analizar compuestos lipídicos específicos, o alternativamente mediante el uso de detecciones de métodos basados en anticuerpos (inmunoensayos) como ELISA u otros. Sin embargo, para los aminoácidos o carbohidratos específicos, será más óptimo el uso de algunos métodos basados en cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)

Conclusiones:

La presencia de cualquiera de los biomarcadores de no embarazo identificará el embrión sin posibilidad de implantación, de modo que esos embriones específicos pueden ser deseleccionados y no transferidos. Por otro lado, la presencia de cualquiera de los 11 biomarcadores de embarazo predecirá el embrión con un alto potencial para una implantación exitosa con un rango de 73-83%; sin embargo, se espera que al usar una combinación de estos biomarcadores de embarazo podamos aumentar el potencial de predecir el implante exitoso a >95%.

Dr. José A. Horcajadas y Dr. Hussain Abdulla

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